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        微生物菌種保藏方法

        作者:樂診生物技術發布時間:2020-07-20 18:28:09瀏覽量:0
          1、傳代保存法:有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時,會很快死亡,因此在這種情況下,只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生產菌種的保存。
         
          傳代保存時,培養基的濃度不宜過高,營養成分不宜過于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產酸菌種,則應在培養基中添加少量碳酸鈣。
         
          一般地,大多數菌種的保藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存,而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。
         
          傳代培養保存法雖然簡便,但其缺點也很明顯,如:①菌種管棉塞經常容易發霉;②菌株的遺傳性狀容易發生變異;③反復傳代時,菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉種,工作量大;⑤雜菌的污染機會較多。
         
          2、液體石蠟覆蓋保存法:該法較前一種方法保存菌種的時間更長,適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥,并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優點,同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產孢能力低的絲狀菌)的保存,而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。
         
          3、載體保存法:即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種,如
         
         ?、偻寥辣4娣ǎ褐饕糜谀苄纬涉咦踊蜴吣业奈⑸锞N的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。
         
          使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是:取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種,培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止,移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封,冷藏或室溫保存。
         
         ?、谏巴帘4娣ǎ喝∏鍧嵉纳?,過60目篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數次,干燥后,置于試管或安瓶管中保持2~3cm深,再經干熱滅菌后,加入1ml菌種培養液,經充分混勻后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌,再進行菌種保藏。
         
         ?、酃枘z保存法:以6~16目的無色硅膠代替砂子,干熱滅菌后,加入菌液。加菌液時,由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,因而需設法加以冷卻。
         
         ?、艽胖楸4娣ǎ簩⒕航胨責胖椋ɑ蚨嗫撞Aе椋┖笤龠M行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,經干熱滅菌后,接入菌懸液,最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效,特別適用于根瘤菌,可保存長達兩年半時間。
         
         ?、蓰熎け4娣ǎ涸邴熎燃尤?0%的水,經滅菌后接種培養,最后干燥保藏。
         
         ?、藜埰V紙)保存法:將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中,常壓或減壓干燥后,置于裝有干燥劑的容器內進行保存。
         
          4、懸液保存法:即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。常用的有,
         
         ?、僬麴s水保存法:適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。
         
         ?、谔且罕4娣ǎ哼m用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗處保存,可長達10年。除此之外,也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。
         
          5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
         
          6、冷凍保存法:適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷,而對其它大多數微生物而言,無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結,都會對菌體造成損傷,因此當采用這種保藏方法時,應注意以下幾點,
         
         ?、僖x擇適于冷凍干燥的菌齡細胞;
         
         ?、谝x擇適宜的培養基,因為某些微生物對冷凍的抵抗力,常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異;
         
         ?、垡x擇合適的菌液濃度,通常菌液濃度越高,生存率越高,保存期也越長;
         
         ?、茏詈迷诰簝炔惶砑与娊赓|(如食鹽等);
         
         ?、菘稍诰簝忍砑痈视偷缺Wo劑,以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣,也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑,但對有些微生物而言,不加保護劑時更有效。
         
         ?、拊瓌t上應盡快進行冷凍處理,但當加入保護劑時,可靜置一段時間后再進行處理。
         
         ?、呔蛣游锛毎?,應在-20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫,此后必須盡快降到貯藏溫度;而對絕大多數微生物而言,則不必如此,如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫,而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍;
         
         ?、嗳暨M行長期保存,則貯藏溫度越低越好;
         
         ?、崛∮美鋬霰4娴木N時,應采取速融措施,即在35~40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說,則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后,應盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降。
         
          常用的冷凍保存法包括:
         
         ?、俚蜏乇浔4娣ǎǎ?0℃、-50℃或-85℃):低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多,有些可添加保護劑。此外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內,再放入低溫冰箱內進行保存的。
         
         ?、诟杀4娣ǎǎ?0℃左右):即將菌種管插入干冰內,再置于冰箱內進行冷凍保存。
         
         ?、垡旱4娣ǎǎ?96℃):是適用范圍最廣的微生物保存法。其操作步驟如下,
         
          a、裝安瓶管:使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2~1ml的這種溶液分裝于安瓶中,或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
         
          b、熔封安瓶管:若直接貯存于氣相液氮中(-150℃~-170℃)時,則不需熔封。
         
          c、檢查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2~30分鐘后,觀察有無色素進入安瓶。
         
          d、緩慢冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱內緩慢冷卻30~60min。
         
          e、速冷:最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。
         
          7、冷凍干燥保存法:其原理是首先將微生物冷凍,然后在減壓下利用升華現象除去水分。事實上,從菌體中除去大部分水分后,細胞的生理活動就會停止,因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。
         
          在進行冷凍干燥時,需注意以下幾個問題:
         
          a、冷凍干燥前的培養條件:首先檢驗菌種純度。一般地說,將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好,如細菌應達到109~1010/ml。
         
          b、菌株號碼等的標記:可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。
         
          c、安瓶的準備:將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,自來水沖洗3次后,蒸餾水刷凈,干燥,塞棉塞,貼標簽,干熱滅菌或溫熱滅菌后,60℃恒溫干燥。
         
          d、添加保護劑:常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
         
          8、Bordelli氏法:取干凈的小試管(8×60mm)塞上棉塞,滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴,然后轉動小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中,在大試管底部事先裝上1.5cm高的(P2O5或KOH),管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,蠟封。將大試管與真空泵連通,抽真空至0.1~0.2mm汞柱時,將玻璃管熔封,置室溫暗處或冰箱保存。
         
          儀器與材料
         
          1、斜面菌種:絲狀真菌、酵母菌、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支。
         
          2、接種用具一套。
         
          3、滅菌物品:1ml、5ml吸管,長滴管,安瓶管,9ml無菌水試管,砂土管,液體石蠟,脫脂牛乳。其中,液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時或1kg/cm2壓力滅菌3次,每次30分鐘。接著檢查是否徹底無菌,即接入肉湯中檢查有無雜菌生長。最后放在60~80℃轟烤以去除水分。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂,然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘,或間歇滅菌3次,經檢查無菌后備用。
         
          4、P2O5,無水CaCl2各一瓶。
         
          5、真空干燥器,真空泵。
         
          方法
         
          1、液體石蠟覆蓋法:取待保存的菌種斜面,用5ml無菌吸管向內加入滅菌石蠟,要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右,若不夠此高度,則常會引起斜面抽干現象。
         
          2、砂土管法:用1ml無菌吸管吸取0.2~0.5ml菌懸液,滴入砂土管中,充分混勻后,將砂土管放入真空干燥器內,抽干,真空干燥器內需放置無水CaCl2。最后,將干燥好的砂土管取出,迅速于火焰上蠟封管口,并在室溫下或冰箱中進行保存。
         
          3、冷凍干燥保藏法:
         
         ?、儆脺缇L滴管取出2滴(約0.1ml)無菌脫脂牛乳,置于無菌安瓶管中,然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液,同樣置于此安瓶管中,充分混勻。
         
         ?、诩邪财抗?,置于100ml燒杯中,將燒杯裝進真空冷凍干燥器的鐘罩內,開機并開冷卻水后,使菌液在-20℃溫度下迅速凍結成固體,然后抽真空使水分升華,2小時后,可以停止冷凍并在稍高的溫度下進行干燥,直至全干為止。
         
         ?、圩詈笕〕霭财抗?,并將其與真空泵連接,再抽真空后,迅速將安瓶管熔封,最后冰箱保存。
         
          4、甘油管保藏法:在5ml菌種保藏管中,將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后,于-20℃冰箱中保存。
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